支原体的分离培养方法及常用培养基

  支原体常用培养基为PPLO，很多公司都有出售。但血清（常用马血清或猪血清）和抗生素(醋酸跎)需要自己添加。

在液体培养基中通常要加入酚红做指示剂的，当培养基由红色变为黄色时，即可判定支原体的生长程度。需要注意的是，支原体的分离可能不太容易，需要多盲传几代。液体培养基变黄后，在固体培养基上单克隆，以纯化分离的支原体。

一、支原体的培养条件

支原体的培养37°C即可。初次分离培养时，在37°C，5-10% CO2条件下效果更好。

二、支原体的鉴定

主要靠菌落染色、生化反应及特异性生长抑制试验等。

（1）Dienes菌落染色

Dienes染色液：

美蓝：2.5g

天青-II：1.5g

麦芽糖：10g

碳酸钠：0.5g

蒸馏水：100ml

染色时，直接吸染色液覆盖菌落，1min后，用生理盐水洗去染色液，低倍镜下可见支原体菌落呈蓝色，而其他菌菌落不着色。

（2）生化反应

根据不同采样部位及对底物的分解或者作为能源，可以鉴别不同支原体。

解脲支原体分解尿素不分解精氨酸，生成NH3使培养基的ph升高，酚红指示剂变红。

人型支原体分解L－精氨酸不分解尿素，生成NH3使PH值升高，酚红指示剂变红。

肺炎支原体分解葡萄糖，使pH降低，酚红指示剂由红变黄。

（3）在含0.002%美蓝的培养基中肺炎支原体能生长且将美蓝还原而退色，其他口腔、唾液或发酵支原体均被抑制生长，此法可鉴定肺炎支原体。

三、常用的支原体培养基配方

（1）基础培养基

Hayflick培养基（PPLO培养基），牛心粉50g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加14g琼脂粉为固体培养基。

（2） 肺炎支原体培养基

基础培养基 70ml

牛血清 （灭活） 20ml

25%的酵母浸液 10ml

50%葡萄糖 1－2ml 0.4

酚红 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10万IU

pH 7.8

（3）人型支原体培养基

基础培养基 70ml

马血清 20ml 25％的酵母浸液 10ml

30% L－精氨酸 0.33ml

0.4%酚红 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10万IU

pH 6.3

（4）解脲支原体培养基

基础培养基 70ml

马血清 20ml

25%的酵母浸液 10ml

30%尿素0.33ml

0.4%酚红 0.5ml

制霉素 0.001g

青霉素 10万IU

pH 6.0

注：支原体能在人工培养基上生长，但是营养要求较高，需要提供胆固醇和酵母才能生长。以上配方中，马（牛）血清提供胆固醇，酵母浸液提供酵母。